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oai:ir.soken.ac.jp:00000976 2023-06-20T14:40:59Z 2:430:20

ショウジョウバエ転写制御因子 FTZ-F1 の標的遺伝子 EDG84A の組織特異的発現を決定する機構の解析 萱嶋, 泰成 カヤシマ, ヤスナリ KAYASHIMA, Yasunari 完全変態昆虫の仲間であるショウジョウバエは、3齢幼虫後期のハイ・タイターのエクダイソンによって、幼虫から前蛸を経て蟻へと形態を変化させる。この時期の実際の分子メカニズムとして、形態形成に関与する多くの転写因子が、エクジステロイドのパルスに応じて時期特異的に発現することが現在までに明らかとなっているが、これら転写因子の多くは、体全体で発現する因子であり、エクダイソンのシグナルが異なった組織の細胞で特異的な遺伝子の発現を制御するためには、これら時期特異的制御を行う因子の他に領域特異性をもたらす別の要素が関与する必要が考えられる。<br />　この領域特異性を生み出す仕組みがどのようにして行われているのか知る目的で、変態期に発現し、蛸のクチクラタンパクをコードしているEDG84A遺伝子の発現制御の仕組みに着目した。EDG84A遺伝子は、Murata et al. 1996によって、前蛸期にエクダイソンのパルスの直後に発現する転写制御因子FTZ-F1の標的遺伝子の一つであることが示された。これらの発現パターンは、FTZ-F1が体全体で発現するのに対して、その標的遺伝子のEDG84Aは体の前半部分表皮だけで発現することから、FTZ-F1は、この標的遺伝子の時期特異性を決める転写制御因子であり、組織特異性を決めるには、別の因子が作用すると考えられた。この組織特異性を生み出すメカニズムを知るために、いくつかの長さのEDG84Aの5’末端領域と、レポーター遺伝子LacZをつないだ融合遺伝子をもつトランスジェニックフライを作製した。前蛸期のLacZの発現パターンについて観察するトランスジェニックフライレポーターアッセイを行ったところ、組織特異的な発現に関与する領域が複数見い出され、本来の発現部位である前半部分表皮における発現活性化には、転写開始部位より上流-193bpから-103bpの領域が必要であることが示された。以上の結果から、EDG84A遺伝子の前半部分表皮における発現活性化をうみだすメカニズムとして、発現時期を決めるFTZ-F1と、発現場所を決める-193bpから-103bpの領域を介して作用する未知の因子による転写制御モデルが考えられた。本研究では、AESAと名付けられたこの未知の因子が何であるのかを明らかにするために、さらにトランスジェニックフライ・レポーターアッセイをおこなって、作用領域について調べた。その結果、-174bpから+50bpまでのconstructを持つトランスジェニックフライでは前半部分表皮においてレポーター遺伝子の発現がみられたが、-151bpまでのトランスジェニックフライでは見られなくなった結果から、レポーター遺伝子の前半部分表皮における発現にとって、-174bpから-151bpまでの領域が必要であることが明らとなった。一方、レポーター遺伝子の前半部分表皮における発現には、-174bpから-146bpまでの約30bpの領域があれば十分であることが判明し、この領域をAEE I と名づけ、さらに解析を行った。AEE I を欠いたconstructを持つトランスジェニックフライを作製してレポーター遺伝子の発現をみたところ、脚・翅原基の表皮においてレポーター遺伝子の発現がみられたことから、脚・翅原基の表皮におけるレポーター遺伝子の発現にとって、AEE I とは別の作用領域があることが判明した。次に、AEE I を欠いたconstructをもとにして、上流をdeleteさせたconstructを作製し、これらをもつトランスジェニックフライでレポーターアッセイを行った結果、AEE I とは別の作用領域がAEE I のすぐ上流の19bpに存在し、前半部分表皮全体の転写活性化に関する作用領域であることが明らかとなり、AEE II と名付けた。また、AEE II の頭部・胸部の胴体部分での作用を抑える領域が、-408bpから-194bpの間にあることが明らかとなった。AEE I の中から前半部分表皮における発現活性化にとって重要な配列を見い出す目的で、AEEを6bpずつ5つの領域に分け、それぞれに塩基置換を施したconstructを持つトランスジェニックフライを作製し、レポーターアッセイを行った結果、前半部分表皮における発現活性化に関わる領域をさらに特定するとともに、AEE II の働きを抑える作用領域がAEE I の中に含まれている可能性を明らかにした。以上の結果より、前半部分表皮における発現活性化に関して、脚・翅原基の表皮と頭部・胸部の胴体部分表皮では異なった仕組みによって発現が促されていることが示唆され、そのための作用領域が複数存在し、その領域を介して作用すると考えられるいくつかの因子の特徴やその局在について予想した。<br />　これら前半部分表皮における発現活性化の作用領域AEE I 及びAEE II に、配列特異的に結会する因子が前蝿期の核抽出液中に存在することを、EMSAによって明らかにした。<br />　AEE I に結合して作用因子となり得る候補としてAEF-1が挙げられ、EMSA競合実験によって結合因子であるのか検討したところ、AEF-1がAEE I に結会するという証拠は得られなかった。<br />　AEE I 及びAEE II に結合する因子の探索を、Yeast One-hybrid法でのスクリーニングと、DNA結合因子データベースからの検索により行った。その結果、AEE I に結合する因子として、p53とX-MyT1が有力な候補となった。EMSAの結果、AEE I に結会している因子のうちで主要なタンパク質は、報告されているショウジョウバエp53認識塩基配列を認識し得る可能性があることを明らかにした。X-MyT1のショウジョウバエホモログはCG4985遺伝子産物であり、CG4985の転写産物は前蛸期のcDNAライブラリーに存在することを明らかにし、Yeast One-hybrid法によってAEE I のDNA塩基配列に結合し得ることを明らかにした。 総研大甲第636号 jpn thesis https://ir.soken.ac.jp/records/976 博士（理学） 2002-09-30 総合研究大学院大学 https://ir.soken.ac.jp/record/976/files/甲636_要旨.pdf application/pdf 313.3 kB 2016-02-17