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oai:ir.soken.ac.jp:00001056 2023-06-20T16:08:48Z 2:430:21

小胞輸送におけるシナプトタグミンファミリーの機能解析三枝, 智香サエグサ, チカ SAEGUSA, Chika 総合研究大学院大学博士（理学）特定の蛋白質や脂質を含む膜画分（小胞）を細胞内小器官間に輸送する機構は、個々の細胞 が形態、機能を維持する上で必要不可欠であり、小胞輸送と呼ばれている。ホルモンや神経 伝達物質放出における小胞輸送機構の解析は古くからなされているが、これらの機能以外に も神経細胞の突起伸長、受精、膜修復等、様々な生命括動に小胞輸送は関与している。ホル モンや神経伝達物質は、細胞内で合成され、小胞体、ゴルジ体を経て、分泌小胞内に貯蔵さ れる。その分泌小胞が、細胞膜上の分泌部位へ輸送され、最終的には分泌小胞膜と細胞膜と が融合し、分泌小胞内容物を細胞外へ分泌する。この一連の過程は、多様な分子によって緻 密に制御されている。特に分泌小胞と細胞膜とが融合し、分泌小胞内容物を細胞外へ放出す る過程は、開口放出と呼ばれている。この開口放出には、いくつかの素過程がある。分泌小 胞はまず細胞膜上の分泌標的部位に結合し（docking）、ATP依存的に分泌可能な状態にされる （priming）。その後、外界の刺激によって、細胞内Ca2＋濃度が上昇し、分泌小胞と細胞膜とが Ca2＋依存的に融合（fusion）し、分泌小胞内容物が細胞外に放出される。この開口放出に関与 する蛋白質としてSNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors） 蛋白質が同定されている。分泌小胞膜上のv-SNARE（VAMP-2）と細胞膜上のt-SNARE （SNAF-25、シンタキシン）との間で複合体が形成されることにより、分泌小胞と細胞膜が融 合すると考えられている。しかし、SNARE蛋白質自身にはCa2＋結合能がないため、細胞内 のC2＋濃度変化を感知するCa2＋センサーがSNARE蛋白質とは別に必要であると考えられる。 Ca2＋結合型膜蛋白質であるシナプトタグミンは、C型タンデムC2蛋白質ファミリーに属し、 調節性開口放出時のCa2＋センサーの有力候補と考えられている。シナプトタグミンファミリ ーのカルボキシル末端（C末端）側には、Ca2＋結合領域であるタンデムC2ドメインを有して おり、Ca2＋と結合し、アミノ末端（N末端）側には膜貫通領域を有しており、分泌小胞膜上に 局在すると考えられている。現在までのところ、シナプトタグミンファミリー蛋白質のよう に分泌小胞膜上に局在し、Ca2＋にも結合する蛋白質は他には見つかっていない。 　近年、タンデムC2蛋白質に類似する蛋白質を網羅的に探索した結果、N末端に、膜貫通領 域を持たず、代わりにRab27結合ドメイン（Slp homology domain、SHD）を持つシナプトタ グミン様蛋白質（Synaptotagmin-like protein、Slp）が同定された。Rab27は、低分子量GTP結 合蛋白質であり、分泌小胞膜上に局在することで、分泌小胞の細胞内輸送を制御する分子で あることが、2000年にヒトおよびマウスで報告された。Slpファミリー蛋白質は、Rab27と結 合することから、細胞内小胞輸送において何らかの重要な役割を担うと考えられる。 Slpファミリーが同定されたことから、C型タンデムC2蛋白質ファミリーは、開口放出時の C2+センサーとして機能するだけでなく、細胞内小胞輸送の様々な過程を制御している可能性 が高いと考えられた。シナプトタグミンファミリー、およびSlpファミリー蛋白質の機能を解 明することは、細胞内小胞輸送機構の統合的な理解につながると考えられる。そこで本研究 では、シナプトタグミンファミリー蛋白質の細胞内局在および発現様式の解析（第I章）と、 Slpファミリー蛋白質の細胞内小胞輸送における機能解析（第II章）を行った。 （第I章）シナプトタグミンファミリー蛋白質のうち、これまで主に解析が進められてい るのは、シナプス小胞開口放出におけるシナプトタグミンIの機能である。それ以外のシナプ トタグミンファミリー蛋白質に関しての解析はほとんど行われていない。シナプトタグミン III、V、VI、Xは系統樹上で同じサブファミリーに属し、共通の生化学的特徴を持つことから、 ユニークな機能を持つサブファミリーを形成すると考えられる。そこで本研究では、シナプ トタグミンIII、V、VI、Xの細胞内局在について検討を行った。ホルモン分泌のモデル細胞 としてPC12細胞を用い、緑色蛍光蛋白質（GFP）標識シナプトタグミンをこの細胞に強制発 現させた。シナプトタグミンIII、V、VI、X-GFPの細胞内局在を共焦点顕微鏡で観察した結 果、シナプトタグミンV-GFPのみが内在性のシナプトタグミンI同様、神経突起の先端に集 積していた。さらに、連続スクロース密度勾配遠心法により細胞内分布を解析した結果、シ ナプトタグミンV-GFPは主に有芯顆粒上に存在することが明らかとなった。シナプトタグミ ンV-GFPが存在する有芯顆粒はCa2十依存的に開口放出をしたことから、シナプトタグミンV がCa2十センサーとしての機能を持つ可能性が示唆された。 　次に、シナプトタグミンVのマウス生体内での発現様式を解析したところ、シナプトタグ ミンVは脳で発現しており、主に有芯顆粒上に分布していることが分かった。また、膵α細胞 においても発現が認められ、シナプトタグミンVがグルカゴン分泌時のCa2＋センサーである 可能性が示唆された。 　（第II章）Slpファミリー蛋白質は、これまでヒトおよびマウスにおいて5種類が報告さ れている（Slp1-Slp5）。本研究では、Slp2-aのマウス生体内での機能解析を行った。まずマウ ス生体内でのSlp2-aの発現様式を調べたところ、Slp2-aは胃において非常に高い発現を示し、 主に胃表層粘液分泌細胞の頂端部にRab27A/Bと共局在していることが分かった。免疫沈降実 験により、マウスの胃においても、Slp2-aとRab27A/Bが特異的に結合していることも明らか となった。さらにSlp2-a欠損マウスを作製し、胃表層粘液分泌細胞の形態を電子顕微鏡で観 察したところ、細胞内の全粘液顆粒数および細胞膜とドッキングしている粘液頼粒の割合が、 Slp2-a欠損マウスにおいて野生型よりも有意に減少していた。頂端細胞膜の形態異常も、Slp2-a 欠損マウスの細胞において多く観察された。また、培養した胃細胞からの基礎粘液分泌量も、 Slp2-a欠損マウスにおいて有意に減少していた。以上の結果から、Slp2－aは胃表層細胞からの 粘液分泌を制御していることが明らかとなった。 　以上、本研究から、1）膵α細胞におけるCa2＋センサー候補分子を初めて同定し（シナプト タグミンV）、2）胃表層粘液分泌細胞からの粘液分泌を制御する細胞内小胞輸送関連分子の 同定（Slp2-a、Rab27A、Rab27B）もすることができた。多様な内分泌、外分泌臓器からの開 口放出機構を統合的に理解するためには、シナプトタグミンファミリー、Slpファミリー蛋 白質の詳細な機能解析を行うことが今後の課題である。総研大乙第169号 thesis 2006-09-29 application/pdf https://ir.soken.ac.jp/record/1056/files/乙169_要旨.pdf https://ir.soken.ac.jp/records/1056 jpn