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oai:ir.soken.ac.jp:00001119 2023-06-20T14:47:34Z 2:430:22

Cell-adhesion activity of cadherin-related neuronal receptor(CNR)Family Cell-adhesion activity of cadherin-related neuronal receptor(CNR)Family 武藤, 哲司 ムトウ, テツジ MUTOH, Tetsuji 総合研究大学院大学 博士（理学） 神経細胞間における情報伝達の場として高度に組織化された接着構造であるシナプスには、カドヘリンやインテグリンをはじめとした様々な接着分子が存在する。CNRファミリー分子群は、Fynチロシンキナーゼに結合し、シナプスに存在するカドヘリン型受容体としてクローニングされてきた。CNRは成体マウス脳において、シナプスに存在することが示されているが、クラシック力ドヘリンが存在するシナプティックアドヘレンスジャンクションではなく、NMDAレセプターなどが存在する、アクティブゾーンと呼ばれる部位に局在する（Kohmura et al．，Neuron 20，1137-1151，1998）。CNRは他のカドへリンファミリーとは異なり、複数のタンデムに並ぶ可変領域エクソンと、定常部位のエクソンからなるゲノム構造を持つ。また最近CNR3において、シナプス形成期から成体にかけての転写産物に、体細胞的なミューテーションが認められ、特にEC1ドメインではアミノ酸置換が頻繁に起こっていることが示唆されている（Hirayama et al．，Gene to Cells 6，151-164，2001）。したがって、CNRには細胞外ドメインの多様性を生み出すメカニズムが存在すると思われ、その多様化していると思われるタンパク質の機能発現様式には大きな注目が集まっている。近年、CNRがマウス胎生期において大脳皮質に発現し、大脳皮質の層構造形成に必須とされる分泌タンパク質であるReelinの受容体として働くことが示されたが、この他にはCNRの脳内での機能は明らかになっていなかった（Senzaki et al．，Cell 99，635-647，1999）。<br />　本研究ではカドヘリンモチーフを持つCNRファミリー分子群の接着活性を解析する事を目的として接着活性系の開発を行っている。まず細胞接着実験を行うため、CNR1タンパク質をL細胞に発現させた。L細胞は古典的に多くのカドヘリンファミリーの接着実験に汎用されてきた細胞株であり、クラシカルカドヘリンの一つのE-cadherinはL細胞に発現すると細胞膜に局在する。しかし、CNR1はL細胞に発現させた場合には小胞体にとどまって、細胞膜上に局在しなかった。このため、種々の細胞株（HEK293T、Neuro2A、COS7、CHO、CHP212、MDCKII）にCNR1タンパク質を発現させてその局在を解析した。すると、HEK293T細胞でのみ、発現させたCNR1が細胞膜に移行していることが明らかとなった。<br />　この現象をふまえ、CNR1を発現させたHEK293T細胞を用いた細胞接着実験を行なったところ、カルシウム依存的な細胞間接着分子としての性質が、CNR1に確認された。次にこのCNR1の接着活性がホモフィリックなものなのかどうかを検証するため、CNR1の細胞外ドメインタンパク質を精製、固相化して、HEK293T細胞を用いた接着実験を行った。すると興味深いことにCNR1非発現細胞もCNR1細胞外ドメインとの結合性を持つことがわかり、CNR1は自らとは異なる分子とのヘテロフィリックな結合活性を持つ事が示唆された。一方で、CNR1ビーズを作製しておこなったin vitroにおけるCNR1同士の結合実験では、CNR1分子同士のホモフィリックな強い結合活性は認められなかった。<br />　CNR1とインテグリンのヘテロフィリックな結合活性はCNR1のEC1ドメインのみを用いた実験でも認められた。さらに、この接着活性はインテグリン特異的接着阻害ペプチドであるRGDSによって大幅に阻害されることから、RGD感受性のインテグリンが受容体であることが示唆された。また、インテグリン複合体でもっとも多く使われるβ1インテグリンサブユニットに対する機能阻害抗体によっても接着が阻害され、CNR1の配列をもった11アミノ酸のペプチドによって、fibronectinに対するインテグリンの接着活性が阻害されることも示された。さらに、CNR1タンパク質を発現したHEK293T細胞の免疫染色像では、CNR1とβ1インテグリンが細胞膜上で共存している像が観察された。以上の結果から、CNR1はインテグリン複合体を相手とした、ヘテロフィリックな細胞接着活性を有することが強く示唆された。<br />　これらの結果を踏まえて、in vivoでCNRとβ1インテグリンとが脳内で相互作用しうるかどうかを検証するため、マウス脳を用いた免疫染色を行った。その結果マウス小脳皮質において、分子層形成に伴いCNRとβlインテグリンの免疫反応は時空間的にほぼ重なって推移していることがしめされた。レーザー共焦点顕微鏡を用いて強拡大で観察した結果、分子層における両者の点状の免疫反応は部分的に重なっていた。また興味深いことに、分子層におけるシナプス新生が一通り完了した生後2週以降、β1インテグリンの免疫反応はCNRに先んじて減弱していた。このことはマウス脳においてシナプス形成の初期段階で、CNRとβ1インテグリンが共役して機能している事を示唆する。<br />　本研究により、今まで細胞膜に移行しないために測定ができなかったCNR1の接着活性の有無が初めて明らかにされた。近年、多くのカドへリンスーパーファミリー分子群がシナプスに発現していることが示されているが、以上の結果は、CNRがシナプスに局在する接着分子としての機能を持ちながら、他のカドヘリンファミリーとは異なった局在機構、接着機能を有し、神経回路形成の局面において独自の役割を持っていることを示唆している。 application/pdf 総研大甲第615号 thesis 2002-03-22 application/pdf application/pdf https://ir.soken.ac.jp/record/1119/files/甲615_要旨.pdf https://ir.soken.ac.jp/record/1119/files/甲615_本文.pdf https://ir.soken.ac.jp/records/1119 eng