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oai:ir.soken.ac.jp:00001380 2023-06-20T14:44:21Z 2:430:27

Analysis of the mechanism of transcription-mediated hyper-recombination in yeast Saccharomyces cerevisiae. Analysis of the mechanism of transcription-mediated hyper-recombination in yeast Saccharomyces cerevisiae. 芹澤, 尚美セリザワ, ナオミ SERIZAWA, Naomi 総合研究大学院大学博士（理学）体細胞における相同組み換えはDNAダメージ修復の重要な過程である。傷害を受けたDNAはその相同な配列を利用して障害を受ける前の状態へ回復される。その機構により危機的な変異は抑えられ、世代から世代へ安定にDNA配列は維持されていく。だが同時に相同組み換えはゲノム中の繰り返し配列のコピー数を変動させたり、染色体間の組み換えでは転座が起こるなどの変化を生じさせる要因となっている。だが減数分裂時における相同組み換えと異なり、体細胞における相同組み換えはゲノム中でランダムに起こる傷害により誘導され、また頻度が低いことから、その分子メカニズムについて解析することは困難であった。 　酵母HOT1配列は新規に挿入した時その近傍の相同配列間の組み換えを数十倍活性化する組み換えのホットスポットとして単離された、リボゾーム遺伝子に由来するDNA断片である。リボゾーム遺伝子（rDNA）は12番染色体上に約150コピーの繰り返し配列として存在しており、一つの単位は35SrDNA、5SrDNAおよびその間の2つの非転写領域から構成されている。その構造は様々な生物種においてよく保存されている。HOT1は非転写領域内の35SrDNA転写のイニシエーター（I：260bp）領域およびエンハンサー（E：310bp）領域の組み合わせからなっており、その構成の要素、および35SrDNAの転写因子PolIがHOT1の組み換え活性に必要であることから、PolIによる転写が組み換えを活性化していると考えられている。だが、転写による相同組み換えの活性化については他にもいくつか例が知られているが、そのメカニズムについては未知であるところが多い。 　今回、HOT1の転写量を変化させることにより組み換えの頻度への影響を見ることで、実際に転写が直接組み換えを活性化しているのか、またそのメカニズムについて知見を得ることを目的として行ったのが本実験である。本実験では転写量を上昇させるためにrDNAを全て欠失させた系（rdnΔΔ）を用いた。通常野生株ではPolIはほとんどが核小体内のrDNAの繰り返し配列上で働いているが、rdnΔΔ株ではrDNAを失うことにより余剰のPolIがHOT1での転写を増加させると考えられる。事実、本実験では転写量が百数十倍まで上昇した系を得ることができた。 　これらの系について組み換えの頻度を見る事を試みたところ、転写量に比例して組み換え頻度が上昇しており、計測できた中で最も頻度が高いものではHOT1活性のない系の約50倍、細胞分裂20回に一回の頻度で相同組み換えが起こっていた。また、HOT1転写量が最も高い系では多くのコロニーが生育せず、あまりにも高頻度な組み換えにより細胞分裂のチェックポイント制御がかかり死に至ったと考えられる。 　HOT1のE配列には複製阻害点（Replication fork barrier；RFB）があり、Foblタンパクが結合して複製フォークの進行を阻害することが知られている。FOB1はHOT1の組み換え活性に必要であることから、rdnΔΔ株においてFOBlの影響を見たところ、fobl欠失株では転写量、組み換え頻度双方においてFOBl株に比べて減少が見られたものの、全く活性がなくなったわけではなかった。このことからFOB1はHOT1の転写に必須ではないがその効率に関わっていると考えられる。また、rDNAにおいてはFoblによる複製阻害活性が組み換えに必要であったことからその活性について調べたところ、rdnΔΔ株と野生株では組み換え頻度に差があるにも関わらず複製阻害活性には差が見られず、HOT1活性は複製阻害によって引き起こされているのではないことが示唆された。 　以上の結果から、転写量の増加により組み換え頻度は直接的に影響を受けることがわかった。またFoblおよびE配列はHOT1においては複製阻害ではなく、PolIによる転写を活性化する因子として働いていることが推測される。今回得られた相同組み換えが高頻度で活性化される系をさらに解析していくことにより、体細胞での相同組み換え活性化のメカニズムについて解明を進めることが出来ると期待される。繰り返し、あるいは散在する相同内例を多く持つ高等生物ではゲノムを安定に維持するため、相同組み換えを抑制する機構があると考えられている。組み換え活性化のメカニズムを利用することにより遺伝子組み換え等の技術の向上に貢献できると考えられる。 application/pdf 総研大甲第773号 thesis 2004-03-24 application/pdf application/pdf https://ir.soken.ac.jp/record/1380/files/甲773_要旨.pdf https://ir.soken.ac.jp/record/1380/files/甲773_本文.pdf https://ir.soken.ac.jp/records/1380 eng