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oai:ir.soken.ac.jp:00001488 2023-06-20T15:58:11Z 2:427:10

Single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins reconstituted in a giant liposome Single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins reconstituted in a giant liposome 尾上, 靖宏オノウエ, ヤスヒロ ONOUE, Yasuhiro 総合研究大学院大学博士（理学）膜蛋白質は膜に存在する蛋白質で生理的に非常に重要な役割を担っている。どんな生 物でも、遺伝子のうち２０－３０％が膜蛋白質をコードしていることが知られ、細胞の 中では信号伝達、イオン濃度勾配の維持、エネルギー変換などの様々な生命活動の基盤 となっている。ところが、膜蛋白質は両親媒性のため取り扱いが難しく、可溶性蛋白質 ほど研究が進んでいない。 　これら膜蛋白質の機能を詳しく理解するためには、当然のことながら、静的な構造情 報だけでなく動的な情報も必要とされる。膜蛋白質の機能に関して特にダイナミクスに 着目すると、細胞中での局在や拡散の様子など蛋白質の位置に関するものや、２種類の 蛋白質の結合・解離など相互作用に関するものを扱った研究はたくさんある。しかしな がらそれらの研究に比べ、１つの膜蛋白質で起こる構造変化のダイナミクスをリアルタ イムで測定した例は極端に少ない。膜蛋白質の構造解析が進んでいないのも一因である が、革新的な構造変化検出法の開発が期待されていることは言うまでもない。 　一方で、近年、蛋白質分子を一分子レベルで観察・操作する技術が飛躍的に進歩して いる。ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡを１塩基ずつ転写する様子や、リボソームがＲＮＡ を１コドンずつ翻訳する様子が観察されたのは良い例である。多分子の挙動を平均化し てしまう生化学的手法では知ることができなかった蛋白質分子の確率的振舞いを一分 子レベルの実験により測定することができる。蛋白質の構造変化についても一分子レベ ルで観察・操作するアプローチは決定的な成果を挙げている。特に、大きなプローブを 使った回転運動の一分子観察法は、蛋白質の微小な構造変化をプローブが大きな動きに 拡大してくれるため、構造変化の様子を視覚的にわかりやすくしてくれる利点がある。 この方法は今までにＦ１－ＡＴＰａｓｅやべん毛モーターなどの回転モーターの回転機 構の解明に多大な貢献してきた。 　このような背景を踏まえ、今回私はこの博士論文で脂質膜に埋もれた膜蛋白質の構造 変化を一分子レベルで観察する新しい方法論を報告する。まず始めに脱水和・再水和法 により膜蛋白質を直径１０～１００マイクロメートルの袋状の巨大膜小胞に再構成さ せる。巨大膜を用いる特長は膜小胞内外の溶液組成をそれぞれ独立に制御可能とする点 にある。次に巨大膜中に埋もれた蛋白質分子をガラス表面に固定させる。さらに膜小胞 内からプローブを結合させ、その動きから構造変化の検出をする。巨大膜小胞内の大き な空間はプラスチックビーズやアクチン線維のようなマイクロメートルスケールのプ ローブの動きを邪魔しない。例としてＡＴＰ存在下にて巨大膜中に埋もれたＦＯＦ１-Ａ ＴＰ合成酵素に結合させたプラスチックビーズの回転運動の観察に成功した。私の知る 限り、大きなプローブを使って膜に再構成した膜蛋白質の構造変化を観察した初めての 例である。ここで開発した技術は他の膜蛋白質の機能やダイナミクスを一分子レベルで 研究するのに役立つであろう。 　この博士論文は４つの章からなる。第１章では研究の背景について概観する。膜蛋白 質とは何か、一分子測定で何がわかるか、蛋白質の構造変化の重要性、ＦＯＦ１-ＡＴＰ 合成酵素とは何かということに触れる。最後に博士論文の目的を述べる。 　第２章ではこの博士論文で用いた実験材料や方法について説明する。まず始めに特別 な薬品の入手先、用いた溶液の組成について記す。次に、ＦＯＦ１や巨大膜などの試料 の調製法について詳説する。カバーガラスやプラスチックビーズの調製法についても述 べる。続いて、顕微鏡を使って、巨大膜の中や界面活性剤中のＦＯＦ１の回転運動を観 察する方法、巨大膜小胞内に蛍光色素をインジェクトする方法について記述する。最後 に顕微鏡イメージングシステムとデータ解析法について詳述する。 　第３章では実験結果について報告する。巨大膜へのＦＯＦ１の再構成は、透析法によ り調製したＦＯＦ１微小膜を脱水和・再水和法により巨大化することで達成した。この ＦＯＦ１を含む巨大膜をＮｉ－ＮＴＡ（nickel-nitrilotriacetic acid）でコートしたカバーガ ラス上に移し、沈降させることでガラス表面へ固定させた。イミダゾール存在下では巨 大膜が固定されなかったことから、確かにＦＯＦ１のヒスチジンタグを介して巨大膜が ガラス表面へ特異的に固定されていることがわかった。続けて、ガラス表面へ固定した 巨大膜中に埋もれた蛋白質へプローブ（ストレプトアビジンビーズ）を結合させるため、 ガラスキャピラリーを用いてビーズを巨大膜小胞内へインジェクトした。ビオチンラベ ルしたＦＯＦ１ではビーズがガラス表面で固定されたのに対し、ラベルしていないＦＯＦ １ではガラス表面にビーズが付かなかった。このことからストレプトアビジンビーズは 確かに巨大膜中に埋もれたビオチンラベルしたＦＯＦ１へ特異的に結合していることが わかった。その上、この巨大膜中に埋もれたＦＯＦ1へ結合したビーズはＡＴＰ存在下で 回転運動を示した。すなわち膜中に埋もれたＦＯＦ１のＡＴＰ加水分解に駆動された回転 運動（構造変化）の観察に成功した。回転方向は反時計回りで予想された通りだった が、回転スピードにはばらつきがあった。これは今回使用したプラスチックビーズの大 きさや形が不均一であったため、それに働く粘性抵抗の違いで説明できる。プラスチッ クビーズの詳細な形が顕微鏡ではわからなかったので、回転運動の解析はこれ以上でき ない。他にはＦＯＦ１に効く阻害剤が回転運動に及ぼす影響を論じる。さらに巨大膜の 実験系で、回転するＦＯＦ１が確実に膜に埋もれているであろう２つの証拠（ＦＯＦ１が 水中では回転しないことと回転していたビーズが２次元拡散することがある）を提示す る。そして最後に巨大膜小胞内に封入した蛍光色素の強度変化から、膜が無傷で特に大 きな穴が開いていないことを示す。 　第４章では、この博士論文で開発した新しい実験系の長所や展望を述べる。巨大膜を 使った方法は、サンプルチャンバーにたくさんの巨大膜があるところに利点がある。一 度サンプルを用意すれば、実験途中に膜を壊してしまっても、すぐに新しい巨大膜を使 って実験を再開できる。大きなプローブを使う方法の長所はデータの解釈が容易という ことと、サンプルへ与えるダメージが少ないことである。今後の課題として巨大膜の膜 電位やイオン濃度勾配を制御する点を挙げる。もしこれらを制御することができければ、 今回開発した構造変化を観察する方法と組み合わせることによりＦＯＦ１がＡＴＰ合成 している時の回転観察や他の膜蛋白質の構造変化観察などに応用できる。総研大甲第1274号 thesis 2009-09-30 application/pdf application/pdf https://ir.soken.ac.jp/record/1488/files/甲1274_要旨.pdf https://ir.soken.ac.jp/record/1488/files/甲1274_本文.pdf https://ir.soken.ac.jp/records/1488 eng