@misc{oai:ir.soken.ac.jp:00001005, author = {小此木, 孝仁 and オコノギ, アツヒト and OKONOGI, Atsuhito}, month = {2016-02-17}, note = {細胞質-核間輸送において核膜孔を自由拡散で通過できない巨大な分子（40kDa以上）は、細胞質または核内にある輸送担体と結合し、核膜孔のゲートを通過することができる。細胞には輸送基質の持つそれぞれの特異的シグナル配列を認識する可溶性受容体が核内輸送、核外輸送に合わせてそれぞれ存在するが、核膜孔通過においてその方向性を決めているキーファクターはsmall GTPaseであるRanが担っている。これら細胞質-核間輸送の機構の解明には、セミインタクト細胞を用いた観察系が大きく貢献してきた。セミインタクト細胞を用いたassay系はジキトニンという界面活性剤を用い細胞質膜に小さい穴をあけた細胞に、外部から細胞質-核間輸送を見たい成分を含む溶液を加えその様子を観察する方法である。しかし、このセミインタクト細胞を用いた観察系では、核内の溶液を自由に変えることが困難であった。今回核膜以外の要素を極力除き、核内外の溶液を自由に変えることができる新しいin vitro assay系を構築するために核膜の再構築を試みた。
　核内外の溶液を自由に変えることができるようにするために、核膜を溶液が自由に浸透できる直方体のアガロースゲルの片側一面にのみ再構築し、核膜に対して左右に核内外が配置されるように設計した。核膜の再構築は、glutathione-beads表面に核膜を再構築する方法を応用して、アガロース切片の表面に平面状に核膜を再構築させた。アガロース切片にグルタチオンを化学架橋し、そのグルタチオン-アガロース切片を上下からカバーガラスで挟み込み切片の左右両側に流路を設けた。このときに片側の流路にGST融合タンパク質として発現させたRanを固定し、Xenopus卵抽出液を流し込むことでアガロース切片の片側のみに平面状の核膜を再構成させた。
　グルタチオン-アガロース切片上に核膜が構築されていることを、脂質の染色と、核膜孔複合体と相互作用する蛋白質の結合から確認した。さらに、IgG-Cy3を用いて漏れがほとんどないことから、平面状に核膜が途切れることなく構築していることを確認することができた。また、高感度蛍光顕微鏡を用いて平面核膜上のGFP-importin βと結合した単一核膜孔像の輝点像を得ることができた。セミインタクトHeLa細胞の核膜とほぼ同じ密度で平面核膜上に核膜孔が存在していた。
　平面核膜に細胞質-核間輸送活性があることを確認するため核内輸送を行なった。核内を洗わない条件での核内輸送assayでは、輸送基質MBP-NLS-GFPの核側での蛍光強度の増加が見られ、核膜1μm²あたり2.3±0.3分子/sの核内輸送がなされ、核膜孔の輸送活性が細胞の核に比べ遜色ない値が得られた。
　平面核膜が核内輸送活性を持つことが確認されたので、核内輸送速度とRanGTP濃度について生化学的に解析した。当研究室で開発した新しいin vitro assay系を用いることで核側のRanGTP濃度をさまざまに変えることができ、今回初めて直接的に核内輸送速度とRanGTP濃度の関連について測定することに成功した。輸送基質核内輸送速度はRanGTP濃度依存的に増加が見られた。
　次に、溶液中にRanGTPを必要とせず単独に核膜孔を通過するβ-cateninあるいはimportin αに関し、核内移行と核外移行を比較した。今回構築したin vitro assay系に、β-cateninあるいはimportin α単独を細胞質側に加えた時の核内移行、また核側に加えた時の核外移行を観察した。コントロールとして、核膜孔と相互作用せず自由拡散で通過できるGFPは、細胞質側、核側どちらに加えた場合でも、核内外の濃度が約90分で平衡に達した。また、核膜孔を自由拡散できないGFPタンデムテトラマーでは、核内外の両方の移行で同じ様に核膜通過は制限された。GFP標識したimportin αを細胞質側に加えると、核側への通過が制限され、測定開始から240分経過しても細胞質側と核側とで濃度が平衡に達しなかった。これはimportin α特異的に観られた。他方、核側へ加えた時の細胞質側への通過は、importin α、β-cateninともに測定開始から120分程度で核内外の濃度が平衡に達した。また、importin αは核膜への結合が観察されたが、その結合にも核内移行と核外移行で結合に違いが見られ核内移行時に大きな結合が見られた。そして、このような結合の非対称性は、importin αが核膜孔に対し相互作用できなくなるNLSを含む条件では見られなかった。さらに核内移行時において、importin αの核膜への結合と核膜孔通過の間に相関がありimportin αの核膜孔通過は核膜孔への結合の強さによって制限されることがわかった。Ran-GTPのエネルギーが関係しない単独で核膜孔を通過するタンパク質分子において通過や核膜への結合が核内移行と核外移行で非対称的であるという生物物理的に面白い現象が見られた。, 総研大甲第863号}, title = {平面核膜再構築系の開発により明らかになった細胞質-核間輸送の非対称性}, year = {} }