| Item type |
学位論文 / Thesis or Dissertation(1) |
| 公開日 |
2012-01-10 |
| タイトル |
|
|
タイトル |
MAPK様キナーゼであるNemo-like kinaseの活性制御機構の解析 |
| 言語 |
|
|
言語 |
jpn |
| 資源タイプ |
|
|
資源タイプ識別子 |
http://purl.org/coar/resource_type/c_46ec |
|
資源タイプ |
thesis |
| 著者名 |
石谷, 閑
|
| フリガナ |
イシタニ , シズカ
|
| 著者 |
ISHITANI, Shizuka
|
| 学位授与機関 |
|
|
|
学位授与機関名 |
総合研究大学院大学 |
| 学位名 |
|
|
学位名 |
博士（理学） |
| 学位記番号 |
|
|
内容記述タイプ |
Other |
|
内容記述 |
総研大甲第1435号 |
| 研究科 |
|
|
値 |
生命科学研究科 |
| 専攻 |
|
|
値 |
19 基礎生物学専攻 |
| 学位授与年月日 |
|
|
学位授与年月日 |
2011-03-24 |
| 学位授与年度 |
|
|
値 |
2010 |
| 要旨 |
|
|
内容記述タイプ |
Other |
|
内容記述 |
MAPK(mitogen-activated protein kinase)ファミリーのSer/Thrキナーゼは、様々な重要な生命現象を制御している。一般的なMAPKは、その活性化ループに存在するThr-Xxx-Tyr（TXY）モチーフのThrとTyrを上流のMAPKキナーゼによってリン酸化されることによって、そのキナーゼ活性を活性化し、さらにホモダイマーを形成して核内に移行する。一方で、異なるメカニズムで活性化するMAPKも報告されている。例えば、JNK2α2は上流の刺激無しにホモダイマーを形成し、そのダイマー内で相互にTXYモチーフのThrとTyrを自己リン酸化することで、そのキナーゼ活性を活性化して、核内に移行する。<br/> Nemo-like kinase (NLK)は、MAPKに構造的に類似したSer/Thrキナーゼである。NLKは様々な転写因子をリン酸化することで、多様なシグナル伝達経路を制御する。最近、ラットPC12細胞において、神経成長因子NGFのシグナルがNLKの「キナーゼ活性の活性化」と「細胞質から核及び細胞辺縁部への局在変化」を促進し、活性化されたNLKが神経突起伸長に貢献することが報告されている。また、PC12細胞にNLKを過剰発現すると、NLKがそのキナーゼ活性依存的に突起伸長を促すことも見いだされている。しかしながら、これらの過程において、NLKのキナーゼ活性と細胞内局在を制御する分子機構についてはほとんど解明されていない。興味深いことに、MAPKのTXYモチーフに該当する部位がNLKではThr(286)-Gln(287)-Glu(288)となっている。このことから、Thr-286のリン酸化がNLKの活性化に重要である可能性が期待できる。しかし、Thr-286をリン酸化するキナーゼは未だに同定されてない。これまでに、NLKのThr-286をValに置換した変異体NLK、NLK T286Vが自己リン酸化活性を失っていることがわかっており、このことから、Thr-286のリン酸化がNLK自身によるものである可能性が期待できる。本論文では、NLKがホモダイマーを形成することで自身のThr-286をリン酸化し、結果としてそのキナーゼ活性を活性化して核移行することを報告する。<br/> 以前の研究ではNLK T286Vが自己リン酸化活性を失っていることはわかっていたが、NLK T286Vがキナーゼ活性をも失っているか否かは解析されていなかった。そこでまず、これを検討したところ、NLK T286Vがキナーゼ活性をもたないことが判明した。次にNLKがThr-286を自己リン酸化するかどうかを検討するために、NLKのThr-286のリン酸化を認識するペプチド抗体（抗pNLK抗体）を作成した。 抗pNLK抗体はHEK293細胞に過剰発現して得たNLK WT（野生型NLK）を強く認識し、NLK K155M（ATP結合部位に変異を導入してキナーゼ活性を失わせた変異型NLK）を弱く認識した。このことから、NLKがThr-286を自己リン酸化する可能性が示された。続いて、NLKの自己リン酸化がNLKの活性化において重要かどうかを検討するために、自己リン酸化したNLKと脱リン酸化処理したNLKのキナーゼ活性を比較したところ、自己リン酸化させたNLKが強いキナーゼ活性を持ち、脱リン酸化したNLKにはほとんど活性が無いことがわかった。以上の結果から、NLKの自己リン酸化が自身のキナーゼ活性を活性化する可能性が示唆された。<br/> 次に、「NLKがintermolecular mannerで自身のThr-286をリン酸化する」という仮説を立て、これを証明するための実験を行った。まず、GFPタグ付きのNLK（GFP-NLK）とFlagタグ付きのNLK（Flag-NLK）をそれぞれ動物細胞に発現させたのちに精製し、GFP-NLKがFlag-NLKをin vitroにおいて直接リン酸化するかを検討した。その結果、GFP-NLKがFlag-NLKのThr-286をそのキナーゼ活性依存的にリン酸化することが明らかになった。つづいて、NLKがintermolecular mannerで自身をリン酸化するためにホモダイマーを形成しているかどうかを、共免疫沈降実験とゲル濾過クロマトグラフィーにより検討した。その結果、NLKがホモダイマーを形成することが明らかになった。また、NLK K155MもNLK T286Vもホモダイマーを形成できたことから、NLKのホモダイマー形成はキナーゼ活性や自己リン酸化活性に依存しないことが分かった。一方で、線虫NLKホモログlit-1の機能欠失変異株の一つにおいて起きている変異と同様の変異を導入した変異型NLK、NLK C425Yはホモダイマーを形成できず、巨大なヘテロ複合体を形成していることがわかった。以前の研究から、NLK C425Yがそのキナーゼ活性と自己リン酸化活性の双方を失っていることが報告されており、このことと上記の結果をあわせて考えると、「NLKのホモダイマー形成が引き金となり、NLKのintermolecular mannerによる自身のThr-286のリン酸化が起き、NLKが活性化する」という可能性が考えられる。<br/> 前述のように、細胞内在性のNLKの活性化と核への局在が相関することがこれまでに報告されている。そこで、NLKの核局在とダイマー形成や自己リン酸化との関係を検討した。HeLa細胞を用いてNLK各種変異体の細胞内局在を検討したところ、NLK K155M、NLK T286VはNLK WT同様、核に強く局在し、対照的にNLK C425Yは核に局在せず、核周辺領域に局在することがわかった。これらの結果から、「NLKのホモダイマー形成がNLKの核局在に必須である」と考えられる。<br/> 次に、細胞内在性のNLKについての解析を、NLKを強く発現する細胞株であるPC12細胞を用いて行った。まず、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、内在性NLKが未処理のPC12細胞においては巨大な複合体として存在し、NGFシグナルに応じてホモダイマーを形成することが分かった。次に内在性NLKの局在を調べたところ、未処理のPC12細胞においては核周辺領域のゴルジ体周辺に局在し、NGF刺激後、核内および細胞辺縁部に局在することが明らかになった。加えて、NGF刺激に応じて内在性NLKのThr-286のリン酸化が増加することも明らかになった。これらの結果は、NGFシグナルがNLKのホモダイマー形成を促進することでNLKの局在変化や自己リン酸化能の活性化を誘導することを示唆する。<br/> 最後に、NLKのPC12細胞における細胞突起誘導能を指標に、NLKのThr-286のリン酸化やホモダイマー形成の生物学的意義について調べた。PC12細胞においてNLK WTを過剰発現すると細胞突起形成が誘導されたが、NLK T286VやNLK C425Yを過剰発現しても細胞突起形成が誘導されなかった。したがって、NLKのThr-286のリン酸化とホモダイマー形成はNLKによる細胞突起の誘導に必須であることが示された。<br/> 以上の結果から、NLKのホモダイマー形成がNLKの活性化における重要なイベントであることが示された。<br/> |
| 所蔵 |
|
|
値 |
有 |
要旨・審査要旨 (302.4 kB)
