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本研究では線虫の母性mRNAであるpos-1mRNAの局在化機構の解明を\u003cbr /\u003e目指した。母性胚性致死遺伝子であるpos-1遺伝子のmRNAは卵母細胞内には一\u003cbr /\u003e様に分布するが、受精後第一卵割中に後極へ局在化を始める。線虫では生殖細\u003cbr /\u003e胞系譜へ局在化する母性mRNAが他にも知られているが,それらmRNAの多くは4\u003cbr /\u003e細胞期以降に局在を開始しており,pos-1mRNAの局在にはそれらとは異なる独\u003cbr /\u003e自の制御機構が働いている事が期待される。また、pos一1タンパク質はpos-1\u003cbr /\u003emRNAの局在開始と同じ時期に発現し始め、その発現が後極に局在していること\u003cbr /\u003eから、pos-1m剛Aの局在はpos-1タンパク質の局在をも制御している事が期待\u003cbr /\u003eされる。\u003cbr /\u003e     本研究を始めるにあたり、まず10一15匹程度の線虫を対象とした再現\u003cbr /\u003e性の高い少数胚in site hybridizationのプロトコルを確立した。本研究では\u003cbr /\u003eRNAを顕微注入した個体等、ごく少数のサンプルを解析したため、少数の胚を再\u003cbr /\u003e現性良く染色出来るin site hybridizationのプロトコルの確立は必要不可欠\u003cbr /\u003eであった。\u003cbr /\u003e     続いて、シス因子解析のために内在性pos-1mRNAの局在パターンを再\u003cbr /\u003e現出来るin vivo assay系を構築する事にした。このn vivo assay系として,\u003cbr /\u003eまずin vitroで合成したレポーターRNA(タグ配列と検討対象の3\u0027UTRなど遺\u003cbr /\u003e伝子配列を含む)を顕微注入し、その後の局在パターンをin site hybridization\u003cbr /\u003eで調べる方法を試みた。この結果、レポーターRNAはpos-1の3\u0027UTR依存的に分\u003cbr /\u003e解されるという意外な現象を見出した。レポーターRNAの分解はpos-1 3\u0027UTR\u003cbr /\u003eに特異的な現象で、また、レポーターRNAの分解はNMD経路に依存しなかった.\u003cbr /\u003eこれらの結果と、レポーターRNAの分解がpos-1mRNAの局在化や翻訳が開始す\u003cbr /\u003eる1細胞期中に起こる事から、レポーターRNA分解活性は内在性pos-1mRNAの\u003cbr /\u003e転写後調節の一端を反映している事が示唆されたが、しかし、胚全体で1細胞\u003cbr /\u003e期に分解される点は内在性pos-1mRNAの挙動と違っており,この系では内在性\u003cbr /\u003epos-1mRNAの局在パターンを再現出来なかった。\u003cbr /\u003e     次にin vivo assay系として試したのが、形質転換体にタグ配列とpos-1\u003cbr /\u003e配列の融合mRNAを発現させ、その局在パターンをin site hybridizationで調\u003cbr /\u003eべる方法である。通常、線虫で外来遺伝子を母性発現させる事は困難なため,\u003cbr /\u003eまず、外来遺伝子を母性発現させる事に適した形質転換法のbiolistic\u003cbr /\u003etransformation法を習得した。また、biolistic transformation法は効率が悪\u003cbr /\u003eく,時間がかかる事で知られていたが、条件検討を行い、世界的に見ても非常\u003cbr /\u003eに高い効率で形質転換体を獲得出来る条件を見つけた。さらに、初期胚でmRNA\u003cbr /\u003eの存在量が多い事が知られているpos-1遺伝子のpromoterを利用した、発現量\u003cbr /\u003eの多い母性発現用プラスミドを開発し、従来の発現プラスミドでは発現量の少\u003cbr /\u003eなさから不可能だった,内在性pos-1mRNAの局在パターンの再現を可能にした。\u003cbr /\u003e以上の技術開発を行った後,形質転換体を用いる方法が内在性のpos-1mRNAの\u003cbr /\u003e局在パターンを再現出来るか調べるため、GFP::pos-1 3\u0027UTR融合mRNAを発現\u003cbr /\u003eする形質転換体を獲得したところ、GFP融合mRNAは2細胞期には生殖細胞系譜\u003cbr /\u003eへ局在化しており、この系では内在性pos-1 mRNAの局在パターンを再現出来る\u003cbr /\u003e事が分かった。その後の解析で、GFP融合mRNA上の他の配列(SL1、pos-1 5\u0027UTR,\u003cbr /\u003eGFP、3\u0027Linker配列)にはGFP融合mRNAの局在化に十分な活性が無い事、pos-1\u003cbr /\u003e3\u0027UTR配列はGFP融合mRNAの局在化に必要な事が分かった。以上の結果から、\u003cbr /\u003eこの形質転換を用いる方法がin vivo assay系としてpos-1mRNAの局在化活性\u003cbr /\u003eの評価に使える事が分かった。また、pos-1mRNAの局在化において3\u0027UTR配列\u003cbr /\u003eが主要な制御配列として働いている事が強く示唆された。\u003cbr /\u003e     そこで、次にこのin vivo assay系を用いてpos-1 3\u0027UTRによる局在\u003cbr /\u003e化制御機構についてくわしく調べる事にした。pos-1 3\u0027UTRに対してdeletion\u003cbr /\u003e解析を行った結果、3\u0027UTRの後半122ntを欠失させると局在化活性が失われる\u003cbr /\u003e事、前半140ntを欠失させても内在性pos-1mRNAと同様に局在化する事が分か\u003cbr /\u003eった。\u003cbr /\u003e     更に比較ゲノム科学的な観点からもpos-1 3\u0027UTRを解析した。近縁線\u003cbr /\u003e虫のC.briggsaeとC.elegansの間ではpos-1 3\u0027UTR配列が保存されている\u003cbr /\u003e事が知られており、C.briggsaeの3\u0027UTRもmRNAの局在化活性を示す事が期待\u003cbr /\u003eされた。そこで、C.briggsaeの内在性pos-1mRNAの局在について調べた所、\u003cbr /\u003eC.briggsaeにおいてもpos-1 mRNAはC.briggsae同様・生殖細胞系譜へ局在化\u003cbr /\u003eしている事が分かった。また、C.briggsaeにGFP::cb pos-1 3\u0027UTR融合mRNA\u003cbr /\u003eを発現させた所,この融合mRNAはC.briggsaeの内在性pos-1mRNA同様の局在\u003cbr /\u003eパターンを示した。この事はC.elegansとC.briggsaeの間で,pos-1mRNAの\u003cbr /\u003e局在化シス因子が保存されている事を強く示唆している。C.elegansにおいて\u003cbr /\u003emRNAの局在に必要な事が分かった3\u0027側の122ntの領域には種間で完全に保存\u003cbr /\u003eされた30ntの配列が存在しており、この配列内にmRNA局在化制御のシス因子\u003cbr /\u003eが存在する事が期待される。\u003cbr /\u003e     トランス因子については、母性致死、母性不妊変異体の内、RNA結合タ\u003cbr /\u003eンパク質をコードする事が知られているものを対象とした小規模なスクリーニ\u003cbr /\u003eングを行い、mex-5,mex-5;mex-6変異体で初期胚におけるpos-1mRNAの局在\u003cbr /\u003eが異常になる事が分かった。初期胚において、MEX-5タンパク質はpos-1遺伝\u003cbr /\u003e子産物とは逆に体細胞系譜へ局在化する。この時期、体細胞系譜ではpos-1\u003cbr /\u003emRNAが分解されており、MEX-5タンパク質はpos-1 mRNAの分解を直接,又\u003cbr /\u003eは間接的に制御してpos-1mRNAを局在させていると考えられる。\u003cbr /\u003e\u003cbr /\u003e", "subitem_description_type": "Other"}]}, "item_1_description_7": {"attribute_name": "学位記番号", "attribute_value_mlt": [{"subitem_description": "総研大甲第1057号", "subitem_description_type": "Other"}]}, "item_1_select_14": {"attribute_name": "所蔵", "attribute_value_mlt": [{"subitem_select_item": "有"}]}, "item_1_select_8": {"attribute_name": "研究科", "attribute_value_mlt": [{"subitem_select_item": "生命科学研究科"}]}, "item_1_select_9": {"attribute_name": "専攻", "attribute_value_mlt": [{"subitem_select_item": "18 遺伝学専攻"}]}, "item_1_text_10": {"attribute_name": "学位授与年度", "attribute_value_mlt": [{"subitem_text_value": "2006"}]}, "item_creator": {"attribute_name": "著者", "attribute_type": "creator", "attribute_value_mlt": [{"creatorNames": [{"creatorName": "NOGUCHI, Koki", "creatorNameLang": "en"}], "nameIdentifiers": [{"nameIdentifier": "0", "nameIdentifierScheme": "WEKO"}]}]}, "item_files": {"attribute_name": "ファイル情報", 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