| Item type |
学位論文 / Thesis or Dissertation(1) |
| 公開日 |
2010-02-22 |
| タイトル |
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タイトル |
ショウジョウバエ超らせん化因子の機能ドメイン |
| 言語 |
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言語 |
jpn |
| 資源タイプ |
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資源タイプ識別子 |
http://purl.org/coar/resource_type/c_46ec |
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資源タイプ |
thesis |
| 著者名 |
小林, 正友
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| フリガナ |
コバヤシ, マサトモ
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| 著者 |
KOBAYASHI, Masatomo
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| 学位授与機関 |
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学位授与機関名 |
総合研究大学院大学 |
| 学位名 |
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学位名 |
博士（理学） |
| 学位記番号 |
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内容記述タイプ |
Other |
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内容記述 |
総研大甲第207号 |
| 研究科 |
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値 |
生命科学研究科 |
| 専攻 |
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値 |
18 遺伝学専攻 |
| 学位授与年月日 |
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学位授与年月日 |
1996-03-21 |
| 学位授与年度 |
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値 |
1995 |
| 要旨 |
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内容記述タイプ |
Other |
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内容記述 |
DNAの超らせん構造は複製や転写などに重要な役割を果たすと考えられている。原核生物では弛緩型DNAから負の超らせんDNAに変換する酵素としてDNA gyraseが存在するが、それに対応する真核生物のDNA topoisomerase II には負の超らせんを導入する活性は認められなかった。しかし、太田と広瀬はカイコ後部絹糸腺抽出液中にDNAに負の超らせんを導入する活性を見出し、精製することにより、その活性がDNA topoisomerase II と超らせん化因子（supercoiling factor; SCF）から成ることを明らかにした（Ohta and Hirose 1990）。そして、そのcDNAがカイコ（Ohta et al. 1995）及びショウジョウバエよりクローニングされた。この翻訳領域には5つのEF hand domainが存在し、実際にCa〓を結合する。また、DNA gyraseのAサブユニットとホモロジーのある領域やC末端側にはカイコとショウジョウバエで共通する4アミノ酸HDEFが存在する。この様な特徴的な構造が超らせん化活性に果たす役割を明らかにするため、本研究ではショウジョウバエのcDNAから大腸菌で発現したタンパク質の超らせん化活性を測定することがらはじめた。カイコのcDNAからはコドン利用頻度の違いから翻訳領域全長のタンパク質が発現できなかったため、ショウジョウバエのcDNAを用いた。N末端およびC末端にヒスチジンのタグをつけた形で発現させ、ニッケル力ラムで精製した因子で調べた。N末端にタグをつけたものは、精製したカイコの因子と同様に超らせん化活性が認められたが、C末端にタグを施したものでは活性が認められなかった。<br /> 次にこうして導入された超らせんの歪みがヌクレオソーム中のDNAの様にタンパク質との相互作用によって束縛されているのか、またはジャイレース反応産物の様に束縛されていないのか、トポイソメラーゼ I 処理により確認した。この処理で超らせん化反応後のDNAは弛緩型DNAとなり、超らせんの歪みがタンパク質との相互作用によって束縛されていないことが判明した。このようにしてショウジョウバエのcDNAクローンがSCFをコードしていることが確かめられたので、次に超らせん化活性におけるCa〓の影響について調べた。Ethylenedioxybis（ethyiamine）-N, N, N', N'-teraacetic acid（EGTA）にてCa〓をキレートした時、超らせん化活性は全く失われた。また、Ca〓濃度は10μMまで減少させてもこの活性は保持され、超らせん化活性にCa〓が必要であることが明らかとなった。<br /> 次に、SCFの各ドメインに注目して各種欠失およびアミノ酸置換変異体を作製し、大腸菌にて発現したタンパク質の超らせん導入活性を調べた。その結果、5つのEFhand domainのうち1つまたは2つを欠失させたものでも50-80％程度の残存活性が認められたが、Kretsingerらの提唱するEFhandのconsensus（Kretsinger 1987）と一致する3つの領域を破壊した変異体ではCa〓結合能がほとんどなくなり、超らせん化活性も10％以下にまで低下した。以上のことからEGTAでCa〓をキレートすると超らせん化活性が失われた結果と照らし合わせると、EFhand domainを介しCa〓で超らせん化活性が制御される可能性が示唆された。gyrase Aとホモロジーのある領域を欠いたものでは顕著な活性の低下は認められなかった。<br /> 一方、C末端の4アミノ酸HDEFを欠失させた変異体では全く超らせん化活性が認められなかった。その原因を調べるため、DNA topoisomerase II との相互作用について検討した。野生型SCFとtopoisomerase II （ホモダイマー）はCa〓存在下でも非存在下でもおよそ1：1のモル比で結合した。超らせん化活性が失われた変異体のうち、EFhand domainを破壊したものではtopoisomerase II との結合が見られたが、C末端HDEFを欠いた変異体では結合が見られなかった．以上の結果からSCFの活性にはEFhand domainがCa〓結合を介して、HDEF配列がtopoisomerase II との相互作用を介してそれぞれ重要な役割を果たすと考えられた．また、本研究からC末端4アミノ酸配列K/HDEL/Fがタンパク質-タンパク質相互作用のより一般的なモチーフとなる可能性が考えられた。 |
| 所蔵 |
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値 |
有 |
| フォーマット |
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内容記述タイプ |
Other |
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内容記述 |
application/pdf |
要旨・審査要旨 / Abstract, Screening Result (277.9 kB)
